Integrative bioinformatics analysis of intra-tumoral heterogeneity in neuroblastoma at single cell level
Analyse bioinformatique intégrative de l'hétérogénéité intra-tumorale dans le neuroblastome au niveau de la cellule unique
Résumé
In this comprehensive study, we delve into the genetic heterogeneity of neuroblastoma (NB), a challenging pediatric solid tumor, by leveraging the power of single-cell and bulk sequencing technologies.Our investigation is two-fold: firstly, we explore the genetic intratumoral heterogeneity (ITH) at a single-cell level. We aim to understand how cell-to-cell allele-specific copy number alterations contribute to genomic and phenotypic variations, influencing the evolutionary trajectory of NB. This includes examining the timing of specific genomic aberrations, the replication timing of individual cells, and the co-evolution of the genome and transcriptome. Additionally, we scrutinize subclonal dynamics and their specific responses or resistances to targeted therapies.For this we combined germline and tumor bulk whole exome sequencing (WES) with ultra-low depth single-cell whole-genome DNA sequencing (scDNAseq) using the 10x Genomics Chromium single-cell CNV kit. A total of 9,410 tumor cells were characterized from 14 patient-derived xenografts (PDX) models of neuroblastoma (NB) and 4 tumor biopsies from NB patients. Additionally, 6 PDX models were subjected to different treatment combinations and bulk WES was conducted pre- and post-treatment.Our scDNAseq analysis identified both polyclonal (11 cases) and monoclonal (7 cases) neuroblastoma genomes through allele and haplotype-specific copy number alterations. We observed 2 to 11 distinct clones per polyclonal tumor. Whole genome duplication events were evident in both polyclonal and monoclonal genomes. Early clonal events included known copy number alterations (losses of chromosomes 1p and 11q, gains in chromosome 17q), MYCN/ALK amplifications, as well as somatic mutations in genes such as ALK, ATRX, TP53, and NF1. Particularly notable was the parallel copy number evolution of two distinct clones, subclone s1/s2, in a PDX model, with clone-specific responses to targeted therapy (Lorlatinib). Replication timing profiles revealed mutually exclusive early and late replication in subclones s1 and s2, respectively. Genotype-to-phenotype analysis indicated preferential expression of the of subclone s1 genotype.Secondly, our study extends to bulk sequencing analysis, particularly focusing on the frequency and impact of ALK (anaplastic lymphoma kinase) alterations, both amplifications and single nucleotide variants (SNVs), in a large cohort of 1092 high-risk NB (HR-NB) patients treated within the European HR-NBL1 protocol. Clonal ALK mutations observed in 33 % were associated with poorer outcomes, whereas subclonal mutations, accounting for 28% of all ALK mutations, did not demonstrate a similar impact on prognosis.We also investigate the prevalence and clinical significance of variations in chromatin remodeling genes (CRGs) and other epigenetic modifier genes (EMGs) in NB. Paired diagnostic tumor and normal DNA from 55 patients were sequenced, either by whole-genome sequencing (16 cases) or whole-exome sequencing (39 cases), complemented by ultra-deep targeted sequencing on 283 NB patients using TSCA®. Ultra-deep targeted sequencing enhanced single nucleotide variations, small insertions/deletions, in chromatin remodeling genes and epigenetic modifier genes in 20% of the cases studied. Our research identifies CRG and EMG variations in 8.4% of NB patients, with the most frequently altered genes including ATRX, SMARCA4, MLL3, and ARID1B. Variations in SMARCA4 and ATRX were more frequent in NB cases compared to the general population, suggesting their crucial role in NB oncogenesis.Altogether, this work provides pivotal insights into the evolutionary trajectories of neuroblastoma (NB) tumors, identifying for the first time distinct replication timing in distinct cellular clones, and the potential for targeting early clonal alterations. Our work also provides further insight into intratumor heterogeneity with regards to ALK, a targetable alteration, as well as CRG.
Notre étude comporte deux volets : premièrement, nous explorons l'hétérogénéité génétique intratumorale (ITH) au niveau d'une seule cellule. Nous cherchons à comprendre comment les altérations du nombre de copies d'allèles spécifiques d'une cellule à l'autre contribuent aux variations génomiques et phénotypiques, influençant ainsi la trajectoire évolutive du NB. Il s'agit notamment d'examiner la chronologie des aberrations génomiques spécifiques, la chronologie de la réplication des cellules individuelles et la coévolution du génome et du transcriptome. En outre, nous examinons minutieusement la dynamique des sous-clones et leurs réponses ou résistances spécifiques aux thérapies ciblées.Pour ce faire, nous avons combiné le séquençage de l'exome entier (WES) de la lignée germinale et de la tumeur avec le séquençage de l'ADN du génome entier d'une cellule unique à très faible profondeur (scDNAseq) en utilisant le kit CNV à cellule unique de 10x Genomics Chromium. Au total, 9410 cellules tumorales ont été caractérisées à partir de 14 modèles de xénogreffes dérivées de patients (PDX) de neuroblastome (NB) et de 4 biopsies tumorales de patients NB. En outre, 6 modèles PDX ont été soumis à différentes combinaisons de traitement et des WES en vrac ont été réalisés avant et après le traitement.Notre analyse scDNAseq a permis d'identifier des génomes de neuroblastomes polyclonaux (n=11) et monoclonaux (n=7) par le biais d'altérations du nombre de copies spécifiques aux allèles et aux haplotypes. Nous avons observé de 2 à 11 clones distincts par tumeur polyclonale. Les événements de duplication du génome entier étaient évidents dans les génomes polyclonaux et monoclonaux. Les premiers événements clonaux comprenaient des altérations connues du nombre de copies (pertes des chromosomes 1p et 11q, gains du chromosome 17q), des amplifications de MYCN/ALK, ainsi que des mutations somatiques dans des gènes tels que ALK, ATRX, TP53 et NF1. L'évolution parallèle du nombre de copies de deux clones distincts, le sous-clone s1/s2, dans un modèle PDX, avec des réponses spécifiques au clone à la thérapie ciblée (Lorlatinib), est particulièrement remarquable. Les profils de synchronisation de la réplication ont révélé une réplication précoce et tardive mutuellement exclusive dans les sous-clones s1 et s2, respectivement. L'analyse génotype à phénotype a indiqué une expression préférentielle du génotype du sous-clone s1.Deuxièmement, notre étude s'étend à l'analyse du séquençage en masse, en se concentrant particulièrement sur la fréquence et l'impact des altérations ALK (lymphome anaplasique kinase), à la fois les amplifications et les variants nucléotidiques simples (SNV), dans une grande cohorte de 1092 patients atteints de NB à haut risque (HR-NB) traités dans le cadre du protocole européen HR-NBL1. Les mutations ALK clonales observées dans 33 % des cas ont été associées à des résultats plus défavorables, tandis que les mutations subclonales, qui représentent 28 % de l'ensemble des mutations ALK, n'ont pas eu un impact similaire sur le pronostic.Notre recherche identifie des variations CRG et EMG chez 8,4 % des patients atteints de NB, les gènes les plus fréquemment altérés étant ATRX, SMARCA4, MLL3 et ARID1B. Les variations dans SMARCA4 et ATRX étaient plus fréquentes dans les cas de NB que dans la population générale, ce qui suggère leur rôle crucial dans l'oncogenèse du NB.Dans l'ensemble, ce travail fournit des informations essentielles sur les trajectoires évolutives des tumeurs du neuroblastome (NB), en identifiant pour la première fois une synchronisation distincte de la réplication dans des clones cellulaires distincts et le potentiel de ciblage des altérations clonales précoces. Notre travail fournit également des informations supplémentaires sur l'hétérogénéité intratumorale en ce qui concerne l'ALK, une altération ciblée, ainsi que le CRG.
Origine | Version validée par le jury (STAR) |
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